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人气指数: 发布时间:2015-09-21 10:06  来源:http://www.plusonespro.com  作者:中国期刊库
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    【摘 要】目的:对抗体类生物治疗药物活性测定方法进行研究分析。方法:通过基于细胞的生物活性测定方法、基于新技术的生物学活性测定方法、生物学试验的方法来进行分析与研究。结果:基于细胞的生物活性测定方法有细胞增殖抑制法、细胞毒性法、补体依赖的细胞毒法、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性法、这几个方面。基于新技术的生物学活性测定方法有表面等离子共振效价测定法、均相时间分辨荧光、 Alpha技术、荧光染料标记法这几种。结论:越来越多的新型技术用于单抗药物的活性检测,为抗体药物的质量提供了新的保障,对国内抗体药物研发企业在质量控制尤其是活性测定方面具有重要的指导作用和参考价值。
    【关键词】抗体类生物治疗药物;活性;测定方法
    抗体类生物治疗药物的活性测定在质量控制中至关重要。目前抗体药物的活性分析方法主要是体外( in vitro) 检测,其中基于细胞的分析方法由于其具有操作简便,周期短,特异性好,变异度小等优点得到广泛应用。为了获得反应性理想的细胞和简便易行的检测方法,构建转基因细胞成为目前常用的策略之一。此外,一些新型技术也快速应用于抗体类药物的活性评价中。
    1 资料
    结合抗体类生物治疗药物活性测定方法的现状以及发展趋势,主要从基于细胞、转基因细胞以及新技术应用三方面对抗体药物活性测定方法进行简要综述,为抗体药物的研发和质量控制提供新思路。
    2 方法
    2.1 基于细胞的生物活性测定方法
    2.1.1 细胞增殖抑制法
    针对生长因子靶点的抗体药物多是采用细胞增殖抑制的方法来反映抗体的生物学活性,包括抗血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)单抗[1]、抗人表皮生长因子受体2(humanepidermalgrowthfactorreceptor2,HER2)单抗及抗人表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR或HER1)单抗等。其中抗VEGF单抗的经典测活方法是人脐静脉内皮细胞(humanumbilicalveinendothelialcell,HUVEC)增殖抑制法,即在刺激因子VEGF存在的情况下,抗VEGF单抗能够以剂量依赖性的方式抑制HUVEC细胞的增殖。抗HER2单抗的活性测定通常选取HER2阳性的乳腺癌细胞,如BT474、SK-BR-3、SKOV3[2]等作为靶细胞,抗体与靶细胞表面HER2抗原结合后,能够有效抑制细胞生长信号传递,从而抑制细胞增殖。抗EGFR靶点单抗也是通过特异结合并封闭表皮生长因子受体,有效抑制肿瘤细胞生长,如DiFi细胞、A431细胞增殖抑制法等。
    2.1.2 细胞毒性法
    细胞凋亡有两条途径,一是线粒体依赖途径,另一个为死亡受体介导途径。肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-alpha,TNF-α)[3]和受体结合后,可启动死亡受体介导途径,使procaspe-8自我水解、活化,形成活性caspase-8,后者再激活caspase3、6、7等,引起下面的级联反应,导致细胞发生凋亡。重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白的活性测定可以利用其能够抑制TNF-α所引起的敏感细胞系U-937中caspase3/7活化。
    通过Caspase-Glo3/7检测试剂盒中萤光素酶发光信号的改变来反映该制品的活性。此外,针对TNF-α的单抗还可以采用对TNF-α杀伤敏感的细胞系,如小鼠成纤维细胞L929、小鼠纤维肉瘤细胞WEHI164等,抗体能够抑制TNF-α所诱导的细胞凋亡作用,通过检测细胞存活的染色来评价抗体的生物学活性。在细胞存活相关染料的选择上,包括结晶紫、MTT、MTS、CCK-8等在内的染料具有各自的优缺点。
    结晶紫是一种三苯甲烷类染料,常用作生物染色剂和无机离子的显色剂。其染色过程虽然相对简单,但是不能区分死活细胞,只能反映细胞数量。而MTT作为线粒体脱氢酶的作用底物,被活细胞还原成水不溶性的橙黄色甲臜产物并沉积在细胞中,而死细胞无此功能,因此可间接反映活细胞数量,但MTT还原产物不溶于水,需被溶解后才能检测。MTS还原产物是水溶性的甲臜,无需洗涤和溶解步骤,使用更方便,重复性优于MTT[4]。而CCK-8溶液可以直接加入到细胞样品中,溶液相当稳定,对细胞没有毒性,可长时间孵育,是用于测定细胞毒性或细胞增殖试验中活细胞数目的一种简便快速、灵敏度高、重复性好的染料。
    2.1.3 补体依赖的细胞毒法
    单抗药物与靶细胞表面分子结合后,可介导补体C1q结合到抗体的Fc段,并于肿瘤细胞膜上形成类似于穿孔素效应的攻膜复合体(membraneattackcomplex,MAC)[5],造成细胞外离子大量内流,最终导致肿瘤细胞的溶解。CDC生物学活性测定中一个的关键环节是补体的选择及对其质量的控制,补体组分多,且热不稳定,容易失活,目前所用的补体来源包括正常人血清、豚鼠、家兔等,来源复杂、剂型不同,因此在CDC实验中需要考虑补体效力、稳定性,尽量减少活性测定反应终点和测定结果的变异[6]。以CD(clusterofdifferentiation)分子为靶点的单抗药物,如抗CD20单抗、抗CD52单抗等,其生物学活性评价方法主要为CDC活性测定,即将重组抗体进行系列稀释后与高表达相应CD抗原的靶细胞结合,在补体存在的情况下,抗体与细胞表面抗原形成抗原抗体复合物,激活补体经典活化途径,完成攻膜复合物的装配并在细胞表面打孔,最终导致细胞溶解。利用上述检测细胞存活的染料可以对抗体的CDC作用效果进行评价。
    2.1.4 抗体依赖性细胞介导的细胞毒性法
    单抗药物通过Fc段介导的免疫效应除了CDC作用外,另外一个重要的效应即是抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)。传统的ADCC检测方法多为基于新鲜制备的外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)或者自然杀伤细胞(naturalkiller,NK)作为效应细胞的杀伤试验,以上方法存在细胞分离和培养困难、变异大、操作繁琐、高背景值等缺陷。研究表明,在NK细胞中Fc受体(FcR)活化[7],尤其是FcRγIIIa受体(CD16)活化能够引起NFAT(nuclearfactorofactivatedT-cells)信号通路的激活。近年来基于报告基因法已建立了稳定而可靠的抗CD20单抗的转基因细胞ADCC评价方法。
    该方法以WIL2-S细胞系(人B淋巴细胞)作为靶细胞,使用工程改造的Jurkat细胞作为效应细胞,该细胞稳定表达了FcγRIIIa受体和由NFAT应答元件驱动表达的荧光素酶报告基因。当高表达CD20抗原的靶细胞与表达FcγRIIIa受体的Jurkat细胞通过抗CD20单抗桥联时,可引起NFAT荧光素酶报告基因的活化,通过检测荧光素酶化学发光信号来反映抗体的ADCC效应[8]。
    该方法操作简便易行,专属性强、重复性好、准确性高,可作为抗CD20单抗ADCC生物学活性的常规检查方法,用于评价包括人鼠嵌合单抗、人源化单抗、全人源单抗和糖基化改造单抗在内的各类抗CD20单抗的ADCC活性;更重要的是该方法可用于评价糖基化修饰与抗CD20单抗功能的关系,这也为该类制品工艺稳定性评价及结构与功能关系研究奠定基础。

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